У мышей язва желудка

Модель язвы желудка на крысах

Библиографическая ссылка на статью:
Трубицын Р.В., Рудаков О.С., Овсянников Н.И. Методы моделирования ацетатных язв в экспериментальной физиологии // Современные научные исследования и инновации. 2018. № 2 [Электронный ресурс]. URL: https://web.snauka.ru/issues/2018/02/85887 (дата обращения: 14.09.2020).

Индукция язвы у лабораторных животных может осуществляться множеством способов, таких как: воздействие химическими, физическими и биологическими факторами (НПВС [1], этанолом [2], серотонином [3], культурой Helicobacter pylori [4]), нарушением поступления желчи в двенадцатиперстную кишку [5], стимуляцией секреции желудочного сока (индукция индометацином и гистамином [6]), воздействием на нервную систему (операция хронического раздражения блуждающих нервов по В. А. Иванову [5]), ишемией-реперфузией [7], лигированием привратника [8], . Однако, несмотря на множество представленных методов, наиболее оптимальным является метод моделирования хронической пептической язвы с помощью уксусной кислоты.

Существует четыре типа экспериментальных моделей язвенной болезни, индуцируемых уксусной кислотой. Они были разработаны для для исследования противоязвенных препаратов, процесса заживления пептических язв, а также для улучшения оценки негативных последствий применения НПВС для слизистой оболочки ЖКТ. Модели позволяют легко и надежно производить круглые глубокие язвы в желудке и двенадцатиперстной кишке при помощи уксусной кислоты у мышей, крыс, морских свинок, кошек, собак, свиней и обезьян.

Язвенная модель 1-го типа. Процедура начинается с лапаротомии через срединный разрез в эпигастрии крыс, наркотизированных эфирным наркозом. После выделения желудка 0,02 мл 20% раствора уксусной кислоты вводят в подслизистый слой железистой части передней стенки при помощи микрошприца (0,05 мл). В момент инъекции необходимо плотно прижать палец к введенной игле таким образом, чтобы избежать утечки раствора. После инъекции иглу вынимают, а большой палец держится в месте инъекции в течение 45 с, чтобы предотвратить утечку уксусной кислоты при удалении иглы. Точность инъекции легко подтверждается появлением волдыря в месте инъекции. Операция требует примерно 4-5 минут на одно животное. После закрытия живота крыс оставляют в живых. Затем животных умерщвляют через определенные промежутки времени, чтобы оценить заживление язвы. В течение 30 минут после инъекции поверхность слизистой оболочки желудка повреждается. Через пять дней после инъекции уксусной кислоты наблюдаются круглые или овальные глубокие язвы (примерно 50-60 мм 2 ) в антральном отделе или в области, соответствующей месту инъекции недалеко от перекрестка антрального отдела и тела желудка. Следовательно, 5-й день после инъекции кислоты определяется в качестве первого дня язвообразования. Гистологические срезы подтверждают наличие язвы, прободающей всю стену желудка, т.е. мышечная ткань в области язвы полностью отсутствует. В подслизистом слое вокруг краев язвы часто наблюдается лейкоцитарный экссудат, отек и клеточная инфильтрация.

Язвы, полученные с этой моделью, сохраняться более 250 дней без вмешательства. Кроме того, исследования показали, что через 1,5 года после ульцерации язвы рецидивируют в 50% случаев. Недостатком данного метода является то, что после ульцерации внешняя поверхность изъязвленной области обладает высокой адгезией к печени, т.е. данные органы сцепляются между собой.

Язвенная модель 2-го типа. Является методом моделирования язвы двенадцатиперстной кишки и желудка с помощью ограниченного, фокусного воздействия 0,2 мл 100%-ной уксусной кислоты на поверхность серозной оболочки на протяжении 30-60 с. Данная модель язвообразования имеет аналогичный недостаток как у модели l-го типа, т.е. дно язвы прикрепляется к окружающим органам, в частности к печени. Сосудистые и микрососудистые изменения, которые предшествуют некрозу железистых клеток, представляют собой основной шаг в развитии язв в модели 2-го типа у крыс, вследствие чего ишемический некроз приводит к ульцерогенезу. Наконец, заслуживает внимания то, что данная модель в хронической стадии морфологически напоминает язву двенадцатиперстной кишки человека.

Язвенная модель 3-го типа. Проблема адгезии в моделях язвообразования l-гo и 2-го типа привела к необходимости исследования альтернативных методов. Антральный отдел желудка играет важную роль в поддержании целостности желудочно-кишечного тракта с помощью секреции эндогенного трофического гормона гастрина. Чтобы прийти к таким выводам, Yasuhiro Tsukimi и Susumu Okabe в эксперименте на крысах удалили всю слизистую оболочку антрального отдела путем химической абляции [2]. Три дня спустя большая часть антральной слизистой была серьезно повреждена и сывороточный уровень гастрина был значительно снижен. Эта находка позволила создать новую модель желудочной язвы с помощью внутриполостного применения раствора уксусной кислоты. Для этой цели были разработаны круглые щипцы (ID 9 мм), чтобы зажать фундальную область. Раствор уксусной кислоты вводили в зажатой части через антрум. Как и ожидалось, две глубокие круглые язвы, одна на передней стенке, а другая на задней стенке, развились в области, которая была подвергнута действию раствора уксусной кислоты. Такие язвы иногда наблюдается у людей. Дно язв такого типа не спаивается с печенью или любым другим окружающим органом. Следовательно, эта модель язвообразования более похожа на человеческую, чем модели 1-го или 2-го типа. Тем не менее, в отличие от них, модель 3-го типа полностью исцеляется за 6-8 недель после применения кислоты и рецидивы не проявляются. Эта модель может быть особенно полезна для измерения уровня кровотока слизистой методом клиренса газообразного водор0да [9].

Язвенная модель 4-го типа. Для того чтобы получить язву через внутрипросветное применение уксусной кислоты, был немного изменен 3-ий тип модели язвообразования. Во-первых, передняя и задняя стенки тела желудка зажимаются вместе при помощи пинцета, который используется для модели язвообразования 3-го типа. Затем 0,1 мл смеси из 60% уксусной кислоты и 0,2 мл воздуха вводят в просвет вместе с инъекционной иглой через дистальную часть антрального отдела, примерно на 3 мм проксимальнее привратника. Зажимается желудок горизонтально таким образом, что введенный воздух поднимается в верхнюю половину и раствор уксусной кислоты притягивается к нижней половине. Учитывая такое позиционирование, раствор уксусной кислоты контактирует только с нижней половиной зажатой слизистой, в результате развивается язва слизистой оболочки задней стенки желудка. Через 45 с смесь раствора уксусной кислоты и воздуха удаляется из желудка и брюшная полость зашивается. Спустя 3 дня после применения кислоты четко определяется глубокая круглая язва, последовательно развивающаяся в теле желудка только на задней стенке, передняя слизистая остается по существу без изменений у каждого животного [10].

Представленные модели язв весьма напоминают человеческие, как с точки зрения патологических особенностей, так и процесса их заживления. В настоящее время они используются во всем мире для фундаментальных и клинических исследований [11,12,13] .

Источник

Модель язвы желудка на крысах

Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки характеризуется широкой распространенностью, тяжестью течения и тенденцией к хронизации, ведущей к инвалидизации и смертности больных. В патогенезе заболевания основная роль отводится нарушению баланса между факторами агрессии и защиты слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки на фоне изменения нейроэндокринной и иммунной регуляции гастродуоденальной зоны. Основными факторами агрессии являются соляная кислота, пепсин, желчные кислоты, Helicobacter pylori (H. pylory), а защищают слизистую оболочку непосредственно слизь, бикарбонаты, гидрофобность эпителия, надлежащее кровоснабжение, обновление клеток эпителиального слоя, а также продуцируемые простагландины и другие медиаторы [1].

В соответствии с этим при лечении язвенной болезни основная задача заключается в снижении факторов агрессии с одновременным повышением защитных механизмов с использованием соответствующих лекарственных препаратов: нейтрализующих кислотно-пепсическую агрессию, повышающих цитопротективные свойства слизистой, обладающих антибактериальным действием, стресспротективных и мобилизующих адаптивные возможности организма [2].

Нами было проведено экспериментальное и теоретическое обоснование по подбору оптимального состава сбора для профилактики и лечения язвенной болезни желудка. При составлении композиции выбор растительных компонентов осуществляли с учетом основных направлений патогенетической терапии (табл. 1) [3; 4].

Возможные виды лекарственного растительного сырья при составлении композиции сбора для лечения язвенной болезни желудка

Лекарственное растительное сырье

Листья подорожника большого (Plantagomajor L.)

Выраженный противоязвенный, противовоспалительный, обволакивающий эффекты, регулируют секреторную функцию желудка

Трава сушеницы топяной (Gnaphalium uliginosumL.)

Гастропротекторный, антацидный и противовоспалительный эффекты, ускоряет процессы регенерации в слизистой оболочке желудка

Корневища и корни девясила высокого (Inulahelenium L.)

Увеличивают выработку слизи в желудке, нормализуют секреторную функцию, снижают кислотность желудочного сока, ускоряют процесс заживления и рубцевания язв, улучшают микроциркуляцию в сосудах слизистой оболочки желудка

Цветки ромашки аптечной

Спазмолитический, противовоспалительный эффекты, регулируют секреторную функцию ЖКТ, ускоряют процессы регенерации в слизистой оболочке желудка

Корни солодки голой (Glycyrrhizaglabra L.)

Снижают пептическую активность желудочного сока, улучшают микроциркуляцию в сосудах слизистой оболочки желудка. Оказывают выраженный противоязвенный, спазмолитический, противовоспалительный эффекты

Трава горца птичьего

Спазмолитический, противовоспалительный эффекты, улучшает микроциркуляцию в сосудах слизистой оболочки желудка

Листья крапивы двудомной

Регулируют секреторную функцию ЖКТ, улучшают пищеварение

Плоды рябины обыкновенной (Sorbusaucuparia L.)

Снижают пептическую активность желудочного сока, источник витамина С

Обоснование оптимального состава сбора, разрабатываемого для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка, подтверждали экспериментально путем скрининга биологической и фармакологической активности [5]. Далее нами был получен 8-компонентный растительный экстракт на основе сбора.

В связи с этим целью нашего исследования явилось определение противоязвенной активности комплексного растительного экстракта.

Материал и методы исследований

Объектом исследований служил экстракт сухой, полученный из следующих видов растительного сырья: листья Plantago major L. (187,5 г), трава Gnaphalium uliginosum L. (187,5 г), корневища и корни Inula helenium L. (187,5 г), цветки Matricaria chamomilla L. (125 г), корни Glycyrrhiza glabra L. (125 г), трава Polygonum aviculare L. (62,5 г), листья Urtica dioica L. (62,5 г), плоды Sorbus aucuparia L. (62,5 г). В полученном экстракте содержатся каротиноиды, полисахариды, флавоноиды, дубильные вещества, тритерпеновые сапонины, стероиды, белки, сесквитерпеновые лактоны, слизи, смолы, органические кислоты, витамины, макро- и микроэлементы, эфирные масла и другие природные соединения. Стандартизация экстракта осуществлена по сумме флавоноидов. Наличие указанного спектра биологически активных веществ предполагает потенциальную противоязвенную активность полученного экстракта.

Работа выполнена в соответствии с Федеральным законом «О лекарственных средствах», «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств». Эксперименты выполнены на 120 нелинейных крысах-самцах с исходной массой 180-200 г и 164 белых беспородных мышах-самцах с исходной массой 18-22 г. Животных получали из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России и содержали в условиях вивария со свободным доступом к корму и воде. Фармакологические исследования проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986), Приказу МЗ РФ за № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики». Дизайн исследований одобрен биоэтической комиссией ФГБНУ ВИЛАР.

Предварительно проводили оценку острой токсичности (по методу Кербера) полученного экстракта на белых беспородных мышах-самцах с исходной массой 20-22 г при введении per os в виде водного раствора в диапазоне доз 50 мг – 1000 мг/кг. Контрольным животным вводили воду очищенную в эквивалентном объеме. Максимально допустимый объем введения жидкости в желудок мышам составлял 0,5 мл. Установлено, что введение экстракта в указанных дозах мышам не приводило к их гибели на протяжении всего периода наблюдения (14 суток), лишь при введении высоких доз экстракта (800-1000 мг/кг) отмечали ограничение двигательной активности, отказ от корма, учащенное мочеиспускание в первые 3-5 часов после введения экстракта, а к 18-20 часам вечера поведение, внешний вид их не отличались от интактных животных.

На модели стрессовых язв определены экспериментально-терапевтические дозы полученного экстракта с использованием противоязвенного индекса Паулса, которые соответствовали 100-350 мг/кг. Дозы 400 мг/кг и выше не имели преимуществ. Поэтому все последующие эксперименты проведены с использованием дозы – 150 мг/кг.

Противоязвенную активность водного раствора комплексного растительного экстракта в экспериментально-терапевтической дозе 150 мг/кг и препаратов сравнения: в изоэффективных дозах бефунгин (0,3 мл/кг) и ранитидин (50 мг/кг), проводили на моделях стрессовых язв у мышей, «ацетилсалициловой» и «бутадионовой» язв у крыс [1].

Стрессовые язвы у мышей вызывали подвешиванием их за шейную кожную складку на 24 часа, а затем оценивали влияние лекарственных средств с вычислением противоязвенного действия. Предварительно мыши были распределены на группы: интактная (10 мышей); контрольная (8 мышей), опытная 1 (8 мышей); опытная 2 (8 мышей), опытная 3 (10 мышей). Животным опытной 1 вводили в желудок через зонд исследуемый экстракт в экспериментально-терапевтической дозе 150 мг/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней предварительно и за 1 час до стрессорного воздействия. Мышам опытной 2, опытной 3 вводили референтные препараты в изоэффективных дозах бефунгин (0,3 мл/кг) и ранитидин (50 мг/кг) по аналогичной схеме. Животным контрольной группы вводили в эквиобъемном количестве воду очищенную по аналогичной схеме. Животные интактной группы служили дополнительным контролем. Животные всех групп, кроме мышей интактной группы, за 1 сутки до иммобилизации лишались корма, воды и подстилки.

Модель экспериментальной ацетилсалициловой язвы крыс создавали введением контрольным и опытным животным per os ацетилсалициловой кислоты в дозе 150 мг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней. Эксперименты проведены на белых крысах, которые были распределены на группы: интактная (8 крыс); контрольная (8 крыс); опытная 1 (8 крыс); опытная 2 (8 крыс); опытная 3 (8 крыс). Опытной 1 вводили экстракт в виде водного раствора в экспериментально-терапевтической дозе 150 мг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней с начала эксперимента; опытной 2 – бефунгин в изоэффективной дозе 0,3 мл/кг; опытной 3 – ранитидин в изоэффективной дозе 50 мг/кг, контрольной группе крыс – воду очищенную в эквиобъемном количестве и по аналогичной схеме. Интервал введения ацетилсалициловой кислоты и лекарственных веществ, а также воды составлял 4-5 часов. Интактные крысы служили дополнительным контролем. Определение противоязвенной активности исследуемого экстракта и референтных средств проводили спустя 18 часов после последнего их введения.

Также противоязвенную активность экстракта изучали в условиях модели «бутадионовой язвы». Белые крысы в данном эксперименте были распределены на группы: интактная (8 крыс); контрольная (24 крысы); опытная 1 (24 крысы); опытная 2 (24 крысы); опытная 3 (24 крысы). Язвенное поражение слизистой желудка воспроизводили внутрибрюшинным введением бутадиона в дозе 100 мг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней подряд. С четвертого дня опытным 1, 2, 3 вводили в желудок экстракт, бефунгин, ранитидин в указанных дозах соответственно 1 раз в сутки в течение 10 дней. В контроле крысам вводили эквиобъемное количество воды очищенной в аналогичном режиме. Интактные животные служили дополнительным контролем. Эвтаназию животных опытных 1, 2, 3 и контрольных проводили на 7, 14 и 21-е сутки с начала опытов в СО2 камере. После вскрытия животных измеряли площадь язвенных дефектов в мм 2 , а также вычисляли индекс противоязвенного действия исследуемого экстракта и референтных препаратов [6].

Оценку фармакотерапевтической эффективности экстракта проводили по окончании экспериментов. Животных подвергали эвтаназии в СО2 камере, вскрывали желудки, промывали слизистую оболочку физиологическим раствором и макроскопически с использованием лупы определяли характер и количество деструктивных поражений на слизистой желудка. Индекс Паулса (ИП) вычисляли по формуле: ИП=А×В/100, где А – среднее количество язв на одно животное; В – количество животных с язвами в группе. О противоязвенном действии (ПД) экстракта судили по отношению ИП в контроле к ИП в опытной группе животных (ПД = ИПк/ИПо), при ПД 2 и более считали, что экстракт, а также референтные препараты оказывают противоязвенное действие.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6,0 (США). Полученные в ходе экспериментов данные обработаны статистически общепринятыми методами для малой выборки с определением средней величины (М) и стандартной ошибки среднего (m) с использованием формулы М±m. Достоверность результатов (Р) оценивали с применением t-критерия Стьюдента [7]. Различия принимали значимыми при Р£0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Проведено изучение влияния экстракта на течение стрессовых язв в желудке у белых мышей. Полученные данные представлены в таблице 2.

Влияние полученного экстракта, бефунгина и ранитидина на течение стрессовых язв в желудке белых мышей (М±m)

Источник